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植物組織培養操作技術

優質內容 來源:山東組培試劑公司 時間:2021-04-27 16:00:29 瀏覽:0

  植物組織培養快繁技術是生物技術領域中的一項新技術,也是高科技技術。以前大多停留在實驗室階段,如今部分企業已經實行產業化市場運作,直接服務于經濟發展。植物組織培養生產是一個系統工程,從一個外植體(芽、側芽、葉片、莖段、花梗、花托、根段、根芽等)→啟動培養產生中間繁殖體→中間繁殖培養→生根幼苗培養→試管苗馴化移栽→田間定植,這些環節都需要熟練的操作技術,才能保證生產計劃的按時完成。操作技術主要包括熟練地配制培養基,具備嫻熟的接種技術,掌握各種滅菌技術,以最大限度地減少污染的發生。操作人員應具備一定的化學知識,以對實驗室基本設備進行日常管理及維護。

植物組織培養操作技術

  1 溶液配制技術

  組培工作中需要配制一定濃度的培養基母液、滅菌劑,這也是植物組織培養工作的首要環節,一定要會使用相關的設備儀器,還要懂得各種化學藥品性質,才能掌握各種藥品溶液的配制技術。

  1.1 準備工作

  在配制藥品前,要準備相應范圍的電子天平,仔細核對各種藥品,檢查與潤洗各種玻璃儀器和器皿。

  1.2 操作要點

  1.2.1 電子天平的正確使用及稱量。稱量前清潔、檢查天平水平、調整零點;稱量的最大量不得超過天平的最大負荷;具有腐蝕性的化學藥品不得直接放入稱盤內;稱量值超過所需值時用紙筒慢慢攝取,然后關住天平側門使其讀數穩定,直至觀察值達到所需值為準;打開或關閉天平門時動作要輕、慢、穩,以防影響最終讀數;讀數時必須關好天平門,防止氣流影響;稱量完畢后歸零斷開電源。

  1.2.2 溶液混合與溶解。溶液混合時按其化學性質進行溶解,以防止沉淀的產生;溶解時要緩緩加入蒸餾水,不斷用玻璃棒攪拌,注意玻璃棒不要碰到燒杯壁,分多次少量洗滌玻璃棒和燒杯并移入容量瓶中,如果是一定濃度的溶液注意刻度線的標線;對需助溶的物質(激素)加入不同助溶劑,微熱使其充分溶解。

  1.2.3 容量瓶配制精確物質的定容技巧。定容主要是用來配制標準溶液或稀釋溶液的過程,是特指配制一定物質量濃度時的其中一步,具體可分為計算、稱量、溶解、冷卻、轉移、定容、搖勻、貼簽等幾步。①檢漏:檢漏時,檢查橡皮筋是否完好,加水至瓶口標準線附近蓋好瓶塞,將瓶倒立30 s,觀察瓶塞周圍是否漏水,然后將瓶直立,把瓶塞轉動180°后再蓋緊,倒立,觸摸瓶頸,仍不滲水,即可使用。②潤洗:用蒸餾水潤洗3~4次后再用待裝溶液潤洗,以保證定容后溶液的濃度不發生變化。③定容:引流時玻璃棒伸到刻度線以下;熱溶液應涼至室溫后對其進行稀釋,因為溫度升高會使瓶體膨脹,致使所量體積不準確;用少量蒸餾水沖洗玻璃棒、燒杯3~4次,洗出液全部轉入容量瓶中,然后用蒸餾水稀釋,接近容量瓶標線1~2 cm時用膠頭滴管進行滴定以防定容失敗;視線與溶液彎月面最低點恰好相切;容量瓶用完應及時洗滌干凈,塞上瓶塞,并在塞子與瓶口之間夾一條紙條,防止瓶塞與瓶口粘連。

  1.2.4 移液管移取母液的移液技巧。制作培養基時需用不同規格的移液管移取不同體積的母液。分度移液管應從最上面刻度起始往下放出所需體積,不能用多少體積就取出多少體積;管尖插入母液不要太深或太淺;當液面升高到刻度線以上時,快速移去洗耳球,立即用右手食指按住管口,將移液管提離液面,管尖垂直接觸容器內壁,略微放松食指并輕輕轉動移液管,直到溶液的彎月面最低點與頸標線恰好相切為宜,待溶液流盡停留15 s;如果移液管上標有“吹”字,則最后殘留在管內的液滴必須吹出;使用完移液管,清洗其內外壁,再放回原處;清洗、移液過程中溶液不能滴到桌面、地面。

  2 培養基制作技術

  培養基是植物組織培養的“血液”,其成分及供應狀況直接關系到外植體的生長與分化。采用更適于植物生長的培養基提供植物材料生長發育需要的養分和生長調節物質。常用的培養基有MS、1/2MS、White,現以MS為例介紹其制作、分裝與滅菌的操作技術。

  2.1 準備工作

  進行培養基制作前,將所需要的量筒、燒杯、吸管、玻璃棒等儀器放在指定位置。使用前仔細觀察母液是否變色或沉淀以及各種母液的名稱、濃度、配制日期。稱量瓊脂、蔗糖,準備好蒸餾水以及培養瓶等。

  2.2 操作要點

  取適量的蒸餾水放入容器,微熱使瓊脂充分溶化呈現半透明狀,加入蔗糖待其完全溶解,將移取的各種母液加入容器內,并用玻璃棒攪拌使其混合均勻,定容,調整并測其pH值3~4次,最后進行分裝、滅菌。

  2.2.1 pH值。MS培養基的pH值由滅菌前的5.8降到5.5,造成pH值下降的最主要原因是高溫滅菌過程中EDTA鐵鹽與其他微量元素發生相互作用所致。MS培養基的凝固與pH值呈正相關。當pH值低于5.5時,培養基一般不能很好地凝固,隨pH值的提高,培養基的凝固效果明顯改善。植物組織在一定pH值下才能正常生長。因此,在配制時考慮培養基凝固情況的同時,也要注意pH值的大小。

  2.2.2 分裝。分裝時要掌握好分量,以注入培養容器的1/4~1/3為宜。分裝時不要將培養基沾到瓶壁上,分裝后立即上蓋,做好標記。

  2.2.3 高壓濕熱滅菌。培養基采用濕熱滅菌法,把分裝好的培養基置入高壓鍋中,排列均勻,瓶間留有一定空隙,關閉鍋蓋,接通電源。當壓力升至0.11 MPa(溫度121℃)時,維持15~30 min,斷開電源。當壓力降到“0”時,打開排氣閥,排掉剩余蒸汽,打開鍋蓋取出培養基。

  3 滅菌與清洗技術

  在組織培養過程中消毒、滅菌是不可忽視的環節。消毒、滅菌將外植體、接種器材、接種室等帶有的細菌殺死以減少污染,提高試管苗成活率。

  3.1 滅菌

  3.1.1 外植體滅菌。采集的外植體沾有很多污染物,在接種前必須將其放在自來水下沖洗1 h,并將比較大的外植體剪小,進行初步處理以利于在容器中放置和接種過程的操作;將外植體帶入無菌操作室,用75%酒精溶液浸泡10~30 s,然后用0.1%升汞溶液浸泡30 min,用無菌水沖洗3~5次,將外植體上的水珠用無菌紙吸干,然后進行接種。

  3.1.2 用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌。接種過程中可將鑷子、剪刀、解剖刀等浸入95%酒精中,使用前取出在酒精燈火焰上灼燒滅菌,冷卻后立即使用。

  3.1.3 玻璃器皿干熱滅菌。干熱滅菌是利用烘箱加熱到160~180℃以殺死微生物。干熱滅菌的物品要預先洗凈并干燥、包裝,以免滅菌后取用時重新污染。烘箱內放置的物品不宜過多,以免妨礙熱對流和穿透。

  3.1.4 室內空間紫外線和熏蒸消毒滅菌。①紫外線滅菌:在無菌操作間、超凈工作臺用紫外線滅菌。紫外燈距照射物1.2 m以內紫外線殺菌能力最強。②熏蒸消毒滅菌:熏蒸消毒滅菌可采用以下2種熏蒸方法:一是煙霧熏蒸劑。利用殺菌劑的煙霧進行空間消毒。將藥物與易燃發煙物攪拌均勻,點燃后發煙但不能有燃燒火焰,通過殺菌煙霧擴散到房間各個角落,封閉門窗,殺菌效果好。二是氣體熏蒸劑。利用甲醛溶液揮發進行空氣消毒。將2%甲醛溶液(10 mL/m3)加入0.5%高錳酸鉀即可揮發濃霧氣體,散發至整個房間,封閉門窗1 d后通風,可達到很好的消毒效果。

  3.2 清洗

  3.2.1 新玻璃器皿。用1%鹽酸溶液浸泡后用洗衣粉水洗滌,再用清水反復沖洗,蒸餾水淋沖,干燥備用。

  3.2.2 用過的培養瓶。去除瓶內殘渣將培養瓶用洗滌液浸泡,然后用清水洗滌3~4次,倒置于架子上至沒有流水時轉入烘箱中烘烤。

  3.2.3 污染的培養瓶。首先必須高溫滅菌后,再按常規方法清洗。

  4 接種技術

  表面滅菌后的植物材料經過切碎或分離出器官或組織,轉接到無菌培養基上進行誘導培養及快繁。整個接種過程必須在無菌條件下進行。

  4.1 準備工作

  植物材料的選擇和預處理、無染菌的培養苗、75%酒精、無菌水、漂白粉、培養皿,無菌紙、超凈工作臺、滅菌器、剪刀、鑷子。

  4.2 操作要點

  在無菌環境下將植物材料在消毒的接種盤中剪成每芽一段,注意芽上切口離芽不要太近,一般在0.5 cm左右,芽下切口離芽也在0.5 cm左右。打開已準備好的培養基,在酒精燈無菌圈內接入植物材料,接種時植物材料上切口向上,下切口插入培養基中直立,使芽基部緊貼培養基,接種的容器中植入的數目不宜太多,以3~5個為宜,并保持一定距離,然后將蓋子蓋上。接種操作要時間短,速度快,技術到位,防止交叉污染。

  5 植物組織培養操作過程引起污染的原因及對策

  5.1 瓶苗污染與環境污染

  5.1.1 造成污染的因素。培養基及各種使用器具消毒不徹底;外植體滅菌不徹底,有菌殘存在細胞組織中;操作時人為因素帶入和交叉污染;環境不清潔;超凈工作區域污染等。

  5.1.2 控制污染的措施。①器具滅菌:接種用的器具除經過高溫消毒外,還需在接種過程中避免交叉污染,即用剪刀、鑷子對植物莖段進行處理的過程中,每使用1次后,需在酒精燈火焰上灼燒或者插入滅菌器中,輪換使用。②接種過程:在接種過程中,很容易人為帶入各種微生物,引起比較嚴重的污染。應注意以下幾點:接種人員要注意個人衛生,特別是手要認真清洗,并用70%酒精進行消毒,還時常用酒精棉球擦手;用70%酒精擦拭需繼代轉接的培養瓶;在操作區內,不要放入過多的待用培養基,避免氣流被擋住;接種者應當熟練操作技術,做到操作嫻熟、干練。

  5.2 接種前后對環境的滅菌

  接種前打開無菌操作室的紫外燈照射30 min,同時打開超凈工作臺的紫外燈和風機,在操作時關閉紫外燈并調小風速;接種結束后將植物垃圾帶出操作室,并用75%酒精溶液進行拖地,操作結束后打開臭氧發生器定時30 min對整個環境進行滅菌。

  環境污染也會使各個環節的污染明顯增加,嚴重時會使植物組織培養工作無法進行。環境要進行定期的熏蒸消毒,一般用高錳酸鉀和福爾馬林;在接種室和培養室內,平時還需要紫外燈照射消毒;減少環境污染除加強滅菌外,平時應天天清掃,使環境清潔有序。

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